基因编辑类型
根据研究的不同目的,需要制备不同的的动物模型。当为了研究基因的功能时需要过表达或敲除相应基因。如果全身敲除目的基因会导致动物死亡时,或需要在特定的组织敲除基因时,可以制备条件敲除小鼠。为了建立基因突变模型时,制备点突变动物模型。制备基因米乐官方体育app小鼠时,可以进行人源基因的替换。制备不同的动物模型,需采用相应的策略,才能成功获得目标模型。
基因敲除是研究基因功能的重要方法。传统ES打靶敲除方法,周期长,费用高。CRISPR/Cas9在基因敲除方面的优势:效率高,时间短,24天直接获得基因敲除小鼠。
技术一般的流程
设计合成gRNA→ 显微注射→ 小鼠出生检测。
技术优势或适合应用的研究
-效率高,可达90%的敲除效率,并且有一定纯合敲除比例。
-方便检测,从PCR条带的大小,容易区分是否发生敲除。
-时间短,24天获得基因敲除小鼠。
-不受敲除片段大小限制,从几十bp到Mb长度的DNA,都能有效敲除。
成功案例
图1:两个Grna切割位点之间的~550bp基因序列被敲除,PCR检测,相对于野生带773bp,发生敲除的鼠产生~220bp的条带(箭头指向的条带)。
当基因敲除会导致小鼠死亡时,需要条件敲除,才能获得成体小鼠用于研究。条件敲除一般使用Cre-loxp系统,其方法是在基因的关键区域的两侧,插入loxp。loxp小鼠制备好后,与Cre小鼠杂交,获得loxp纯合,Cre阳性的小鼠,这种小鼠在Cre的作用下,loxp发生重组,中间的序列被删除,达到敲除基因的目的。目前已经有数百种Cre工具小鼠,可以根据研究需要,购买或定制Cre工具鼠,在不同的组织器官,达到敲除目的基因。Cre融合ER/ERT2后,可以使用tamoxifen调控Cre入核,实现时间上的调控删除。
图1:通过CRISPR辅助,在关键外显子的两侧通过同源重组,插入两个loxp,在Cre的作用下,loxp之间的外显子被删除,实现基因条件敲除。
技术一般的流程
打靶载体设计→ 载体构建→ 显微注射(EPS打靶)→ 小鼠鉴定。
技术优势或适合应用的研究
-用于敲除致死的基因
-非致死基因,用条件敲除也可以在不同的组织,不同的时间敲除基因,获得更多的实验数据。
成功案例
图2:在关键外显子或非3整数倍的外显子两侧敲入loxp,在Cre的作用下,该区域被删除,导致基因敲除。
图3:设计Loxp插入位点的特异引物与同源臂外侧的引物,通过PCR,可以检测到两个loxp被正确敲入到目的位置,证明获得条件敲除小鼠。
随机转基因是一种经典的过表达基因小鼠制备策略,不同于靶向基因编辑,没有受到新兴基因编辑技术的影响。该方法通过将基因随机整合到基因组中,实现目的基因过表达。
技术一般的流程
过表达载体构建→ 显微注射→ 小鼠鉴定筛选→ 表达检测→ 品系建立。
图1:转基因载体和小鼠制备流程。
技术优势或适合应用的研究
-可以广谱,或组织特异过表达目的基因。
-多拷贝插入,比定点插入表达量更高。
-受整合位置影响,可能表达沉默,或者表达谱错误。
成功案例
图2:通过转基因载体特异的引物设计,检测到转基因阳性的小鼠,一般效率在10-20%。
定点转基因是将转基因表达载体敲入到Rosa26位点,该位点被证明是在所有组织细胞都活跃的区域,不会发生随机转基因中出现的转基因沉默的现象。常用来制作过表达或条件过表达小鼠。条件过表达是在目的基因前面插入loxp包围的Stop序列,阻止目的基因表达。该小鼠模型与Cre小鼠杂交,能够在Cre表达的组织中,删除Stop序列,从而使目的基因发生表达;过表达小鼠直接获得组成性基因表达小鼠。米乐m6app下载安卓的Rosa26位点的定点转基因系统,已经实现长达10kb的定点转基因。
图1:Rosa26位置敲入转基因表达载体,制备定点转基因小鼠.
基因敲入是指在基因组的特定位置插入一段DNA序列,例如给基因加GFP荧光标签标记蛋白,原位敲入制备Cre工具鼠等应用。1kb以下的小片段插入,CRISPR/Cas9效率较高。对于大片段的基因插入,需要使用ES,或者EPS制备策略才能保证项目周期和效率。
图1:把绿色荧光蛋白敲入目的基因的C端,融合表达,示踪目的基因。
技术一般的流程+图解
打靶载体设计→ 载体构建→ 显微注射(EPS打靶)→ 小鼠鉴定。
技术优势或适合应用的研究
-CRISPR用于小片段的基因敲入。
-ES/EPS用于大片段基因敲入。
-给基因加各种标签,原位敲入制备Cre工具鼠。
基因替换指,根据研究需要,将小鼠的基因替换为其它物种的基因。可以将基因的部分功能区,或者全基因进行替换。1kb以下的小片段替换,可以采用CRISPR/Cas9策略。对于大片段的基因替换,需要使用ES,或者EPS制备策略才能成功。
图1:用其它种系的基因,替换小鼠的基因片段。
技术一般的流程+图解
打靶载体设计→ 载体构建→ 显微注射(EPS打靶)→ 小鼠鉴定。
技术优势或适合应用的研究
-CRISPR用于小片段的基因替换。
-ES/EPS用于大片段基因替换。
3)基因米乐官方体育app小鼠的制备,如PD1等免疫检查点米乐官方体育app小鼠的制备。
图1 EPS小片段敲入效率高达90%。
图2 EPS系统对于长达20kb的大片段敲入,也具有很高的效率。
许多疾病由氨基酸突变引起,为了构建此类疾病模型,可以将小鼠的对应基因的位点进行突变。单链DNA在点突变方面有较高的成功率。
图1 单链DNA模板制备点突变小鼠。
图2 PCR扩增包含突变位点的序列,测序检测发生点突变的小鼠,目标碱基出现套峰,证明获得杂合突变小鼠。
技术一般的流程
gRNA设计→ 供体DNA合成→ 显微注射(EPS打靶)→ 小鼠鉴定。
技术优势或适合应用的研究
-氨基酸突变类小鼠疾病模型模拟
-CRISPR点突变效率相对较高